劉妍 1 李向麗 1 李曉璐 1* 中山火炬職業技術學院 廣東中山 528436
摘 要:以地塞米松為代表的糖皮質激素非法添加現象,仍然是我國動物源性食品安全的重要隱患。研究通過螢光微球免疫層析技術,對地塞米松進行了定量檢測。結果發現,所建立的地塞米松檢測方法IC50為0.87 ng/mL,線性範圍為0.1~8.4ng/mL(y =-0.18ln x+0.92,R2=0.99)。檢測組織樣本的最低檢出限為0.7μg/kg,平均相對標準偏差<30%(n=6)。使用30%的甲醇水溶液能一步完成提取過程,平均回收率為78%。
地塞米松(圖 1 a)作為一種長效的糖皮質激素,具有良好的抗炎 抗過敏作用,被廣泛用於動物疾病治療。然而,一些 研究指出,地塞米松因其促進動物生產功能而被非法濫用。在一些功能食品、保健品甚至是一些中藥材中,不法商販通過非 法添加糖皮質類激素,使消費者在食用後短期內出現一些積極作用,但若長期食用則會引起內分泌失調、致畸、致癌、致突變、水腫、糖尿病等不良反應。在化妝品方面,由於糖皮質類激素可以抑制細胞增生,減少 5- 羥色胺的形成,從而對皮膚有一定的嫩白作用 。但在長期使用後,就會造成人體皮膚變薄、毛細血管擴張和毛囊萎縮,輕度受害者會皮膚會恢復到使用前狀態,中度受害者會出現激素依賴性皮炎症狀,重度受害者則會造成更嚴重的後果,比如類固醇性糖尿病、骨壞死和骨質疏鬆、精神失常、消化性潰瘍和高血壓等疾病。因此我國農業部 235 號公告中對動物組織中地塞米松的限量做了具體的規定:肌肉為 0.75μg/kg,肝臟為 2g/kg。
目前動物組織中地塞米松的檢測方法主要有高效液相色譜法 [1]、氣相色譜 - 質譜法 [2]、液相色譜串聯質譜法[3]。雖然色譜方法準確性較高,然而儀器昂貴、操作繁瑣、環境要求高。農產品由於流通時間短(往往只有數小時),檢測方法如果耗時較長將無法實現餐前攔截。因此,建立相對準確、便宜、快速的地塞米松現場速測方法作為實驗室確證方法的補充,有利於完善農產品檢測初篩 - 確證的風險防控體系,保證農產品質量安全。
免疫層析檢測技術(Immunochromatographic Assay,ICA) 的快速發展為地塞米松的現場快速檢測提供了良好的技術基 礎。然而現有的地塞米松免疫層析方法主要基於膠體金標記,雖 然其能直接依靠肉眼觀察結果,但是靈敏度較差且定量不準
確,對於檢測地塞米松這種具有低限量值的藥物有一定的不便性。並且地塞米松是具有限量值的藥物,因此需要在量上判斷 是否超標,而膠體金的定量結果偏差較大。合成螢光素作為免疫反應的指示物能有效地提高免疫分析信號,與膠體金標記相 比靈敏度可提高 10 ~ 100 倍 [4]。然而,其容易光漂白且易被基質干擾,目前成功的免疫檢測產品仍然較少。近年來興起的螢光微球(fluorescent microspheres,FM)納米材料為提高免疫層析靈敏度提供了新的解決方案,其通過將螢光素包裹在螢光微球中,避免了基質和螢光素的近距離接觸,從而避免了螢光信號的淬滅 [5]。並且該類微球已經商品化,批間穩定,標記方便。本研究採用螢光微球標記的免疫層析技術,實現了地塞米松的定量快速檢測。
1. 材料與方法
1.1 材料與試劑
硝酸纖維膜(NC 膜)、螢光矽球墊、樣品墊、吸水紙及 PVC 底板(美國 Millipore 公司);FluoSpheres® 氨基修飾的螢光微球(直徑 0.2 μm、激發波長 505 nm、發射波長 515 nm)(美國 Thermo 公司);糖皮質激素類標準品(加拿大 TRC 公司)。其他試劑均為國產分析純。地塞米松羧基衍生物 (圖 1 b),地塞米松包被抗原(圖 1 c)和抗地塞米松單克隆抗體由深圳市計量質量檢測研究院提供。
1.2 儀器與設備
圖片拍攝設備為華為榮耀 8, 攝像頭覆蓋美國 BIOTEK 540nm±25nm 濾光片;505nm LED 光源 台灣光宏;XYZ3100 點膜儀(美國 Bio-Dot 公司);試紙條讀取儀(深圳市三方圓生物科技有限公司);Milli-Q 水處理系統(美國 Millipore 公司)。
1.3 方法
1.3.1 地塞米松抗體 - 螢光微球偶聯物製備
將免疫微球,EDC,NHS按1:1:1的比例投料,並加入 1000 倍質量的去離子水。活化過夜後,離心去除上清加 入去 pH7.4 的 0.01M PBS 重懸。分別以抗體質量比微球質量 1:10、1:30、1:100、1:200 的投料比混合地塞米松抗體。反應 12 小時後,離心去除上清液,加入復溶液(含 1% BSA、2% 蔗 糖、0.05% PEG 20000、0.1% proclin 300 的 pH7.4 0.01M PBS 溶 液)重懸抗體 - 螢光微球偶聯物。
1.3.3 螢光試紙條的製備
螢光試紙條結果如圖 2 所示。首先將樣本墊浸泡於 20 mmol/ L 磷酸緩衝液(pH 7.4,含 1.0% BSA,0.25% Tween-20、1% PVP K-40、0.5% PEG 40000 和 0.1% NaN3)中,於 60 °C乾燥 2 h;將 地塞米松包被抗原(2.5 mg/mL)和羊抗鼠 IgG(0. 3 mg/mL)噴塗於 NC 膜上,分別作為 TTX 試紙條檢測線(T 線)和質控線 (C 線),於 37 °C真空乾燥 12 h。結合墊噴有 TTX 抗體偶聯螢光微球,室溫真空乾燥 12 h。最後將吸水紙、NC 膜、結合墊和經過預處理的樣本墊順序粘貼在 PVC 底板上,用自動切條機切成 4 mm 寬的試紙條,室溫條件下真空乾燥,備用。
1.3.4 定量曲線的建立
以 T 線螢光信號 /C 線螢光信號(FIT/FIC)為縱坐標,地塞米松標準溶液質量濃度的對數為橫坐標,使用 Origin 8.0 建立四參數擬合曲線。
1.3.5 方法添加回收率選取色譜確證為地塞米松陰性的肌肉和肝臟樣品,地塞米松加標量為 1μg/kg 和 10μg/kg,放置過夜。取 1 g 均質的動物組織,加入 6mL 30% 甲醇水溶液(w/w),渦旋震盪 2 min,2000g 離心 5min,取上清液 0.1 mL 滴加至螢光免疫層析試紙的樣品墊,10 min 後讀取結果。
1.3.6 真實樣品的方法比對
在市場組織採購樣品 100 份(肝臟和肉各 50 份),使用本研究建立的方法和國標 GB/T 20741-2006 畜禽肉中地塞米松殘留量測定液相色譜 - 串聯質譜法所規定的方法進行對照檢測 [23]。
2. 結果與分析
2.1 抗體免疫微球標記投料比
抗體和螢光微球的投料比是製備抗體螢光微球偶聯物的關鍵參數。抗體加入過多,會導致單個微球上帶入過多的抗體,檢測方法的靈敏度下降。而抗體加入不足,會導致部分微球無法偶聯抗體,則免疫層析的背景過高,同樣也會導致靈敏度下降。本研究試驗了 4 個梯度的投料比製備的抗體 - 螢光微球偶聯物。如圖 3 所示,抗體和螢光微球的投料比在 1:30 時,螢光免疫層析最為靈敏。
2.2 免疫層析反應時間
層析反應時間是螢光免疫層析的另外一個重要參數。本研究用空白的蒸餾水和 1.6ng/mL 的地塞米松標準溶液做10min 動態反應試驗。如圖4所示,免疫層析反應在8min時達到平衡,T 線的螢光值與 C 線的螢光比值不發生顯著變化。因此,該試紙在反應 8min 後即可進入螢光免疫層析掃描儀讀數。
2.3 螢光免疫層析方法參數
FluoSpheres 氨基修飾的螢光微球是 Thermo 公司的商品化微球。據張世偉等報導,該微球製備的抗體 - 螢光微球偶聯物在 6 個月常溫保存的螢光衰減< 40%,具有良好的穩定性 [24]。根據微球說明書,該微球的激發範圍為 450-515nm,最佳激發波長為 505nm,發射波長為 505-580nm,最大發射波 長為 515nm。為避免激發和發色光源的波長交叉引起的高背景,本研究選用 505nm LED 光源作為激發光源,並覆蓋 495nm ±20nm 濾光片避免雜光,在光檢測器前覆蓋 540±25 nm 濾光片消除背景。圖 5 展示了在暗室下使用覆蓋 495nm ±20nm 濾 光片的 505nm LED 激發,用手機攝像頭覆蓋 540±25 nm 濾光片的螢光微球免疫層析試紙條觀察結果。在 0.1ng/mL 地塞米松 可將試紙條 T 線螢光強度抑制到等同於 C 線,為該試紙的最低檢測靈敏度。在 8.4 ng/mL 時 T 線幾乎不可見,為線性範圍的最高值。
基於上述條件,本研究採用免疫層析螢光讀數儀對該試紙條建立標準曲線(圖 6),回歸方程為 y = - 0.18ln x + 0.92(R2= 0.99)。以線性範圍的最低點 0.1 ng/mL 乘以其樣本前處理稀釋倍數 7 得到其最低檢出限為 0.7 μg/kg。糖皮質激素是一類結 構相似的藥物家族,表 1 展示了該方法檢測其他糖皮質激素的 交叉反應。該方法與醋酸地塞米松、倍他米松、倍氯米松等地 塞米松類似物具有一定的交叉反應。因此,在試紙條檢測的樣 品為陽性結果需要儀器確證時,需要同時檢測