昨天，華東師大李大力和劉明耀教授團隊同海南醫學院第一附屬醫院馬燕琳教授以及廣西醫科大學第一附屬醫院賴永榕教授合作，在Cell Research雜誌發表研究論文，有望成為治癒β地中海貧血的基因治療手段。
李大力教授(左二)與劉明耀教授(左三)團隊
什麼是地中海貧血?
地中海貧血(簡稱「地貧」)是最常見的單基因常染色體隱性遺傳性疾病之一，依據不同的致病基因，分為α和β地中海貧血兩種。其分子機制為珠蛋白基因缺陷導致珠蛋白鏈合成障礙，使形成血紅蛋白四聚體的α鏈/非α鏈比例失衡，進而引起紅細胞破壞，造成溶血性貧血。
重度α地貧的胎兒一般因嚴重水腫在胎兒期或出生後數小時死亡，主要通過產前診斷來干預。重度β地貧患者在出生後出現進行性貧血，需要進行終生輸血和除鐵治療，在我國每年的治療費用在10-20萬元左右。由於血源緊張加上費用高昂，我國絕大多數病人無法接受規範治療，平均存活年齡也僅在10歲左右。
論文共同第一作者華東師大王立人、李林夕(右)
目前，全世界大約有8000-9000萬β地貧基因攜帶者。在香港、廣東地區，β地貧基因攜帶率分別為3.4%、2.54%，而在廣西，攜帶率高達6.43%。如此高的攜帶率和潛在發病率，給社會和家庭帶來了沉重的負擔，成為嚴重的公共衛生問題。
正常情況下，人體在胎兒期主要依靠γ珠蛋白與α珠蛋白形成胎兒血紅蛋白四聚體(HbF)，到成年後β珠蛋白開始表達而γ珠蛋白基因逐漸沉默。
然而大量研究發現，很多β地貧病人中由於攜帶其他突變，造成γ珠蛋白基因(HBG)在成年仍然激活，高表達的γ珠蛋白能替代缺失的β珠蛋白與α珠蛋白形成HbF，而使病人不表現出明顯的貧血症狀。
因此，通過在成人紅細胞中激活胎兒期的HBG表達，彌補β珠蛋白表達不足，是治療β地貧的重要策略之一。
通力協作有突破
1月8日，華東師大李大力和劉明耀教授團隊同海南醫學院第一附屬醫院馬燕琳教授以及廣西醫科大學第一附屬醫院賴永榕教授合作，在Cell Research雜誌發表了題為Reactivation of γ-globin Expression through Cas9 or Base Editor to Treat β-Hemoglobinopathies的研究論文。
該研究證實了通過CRISPR/Cas9或者單鹼基編輯技術，高效編輯HBG1/2啟動子上的BCL11A結合位點，能夠重新開啟β地貧患者細胞內γ珠蛋白的表達，顯著改善患者紅細胞的成熟，有望成為治癒β地中海貧血的基因治療手段。
研究成果在Cell Research刊發
有研究顯示，在一部分重症β地貧患者中，天然攜帶著HBG啟動子區域-102～-114位的缺失，這部分患者β地貧的症狀很輕或者幾乎沒有症狀。最近的研究顯示，該區域正是轉錄抑制因子BCL11A的結合位點【1】。Mitchell J. Weiss課題組通過慢病毒遞送CRISPR/Cas9系統的方法，從概念上證明了該靶點確實可以提高HBG表達，但是遞送方法和效率都無法達到臨床應用的要求【2】。利用Cas9 RNP電轉的方式在造血幹細胞中可以實現非常高效的編輯，是目前最有效的轉導方式之一【3】。
本研究通過體外電轉Cas9/sgRNA RNP的方法，在該啟動子區域的編輯效率均值達到了85%以上，並且基因編輯本身對細胞的毒性較低。經過編輯以後，細胞內的γ珠蛋白在mRNA水平以及蛋白水平都得到了顯著的提升。更重要的是，這些經過編輯的患者造血幹細胞在誘導紅系分化後，表型得到了明顯的改善，它們在脫核率、細胞大小和細胞形態上都趨近於正常人的細胞。
然而，野生型Cas9切割DNA雙鏈引發NHEJ修復從而破壞目的片段，但DNA雙鏈斷裂始終是一個風險因素，而單鹼基編輯方法幾乎不引起雙鏈斷裂，有望克服這個潛在風險。該研究首次嘗試了通過單鹼基編輯的方法直接破壞BCL11A在HBG啟動子上的結合位點，並且成功達到了約20%的總體鹼基突變效率，在對實驗細胞總體mRNA進行檢測後，經過單鹼基編輯的細胞中HBG基因的表達量同樣得到了顯著的提高。
β地貧患者造血幹細胞中實現高效、低毒的基因編輯，重激活HBG表達
綜上所述，該研究成功地建立了具有臨床轉化價值的造血干/祖細胞基因編輯技術體系，通過電轉Cas9 RNP高效編輯HBG啟動子，為重症β地貧患者提供了有望徹底治癒的新方法。同時，本研究率先證明單鹼基編輯器編輯技術對於治療β血紅蛋白病的可行性與有效性，後續研究將進一步提高該位點的單鹼基編輯效率，為臨床應用提供更安全的策略。
據悉，華東師大王立人，李林夕和海南醫學院附屬第一醫院的馬燕琳為本文共同第一作者，廣西醫科大學附屬第一醫院賴永榕、華東師大李大力、劉明耀為本文共同通訊作者，湘雅醫院血液科付斌主任等參與了本項研究工作。
參考文獻：
1. Liu, N., et al., Direct Promoter Repression by BCL11A Controls the Fetal to Adult Hemoglobin Switch. Cell, 2018. 173(2): p. 430-442 e17.
2. Traxler, E.A., et al., A genome-editing strategy to treat β-hemoglobinopathies that recapitulates a mutation associated with a benign genetic condition. Nat Med, 2016. 22(9): p. 987-90.
3. Wu, Y., et al., Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells. Nat Med, 2019. 25(5): p. 776-783.