分子生物學!現代最需要學習的一份知識

官生君 發佈 2020-01-12T12:05:51+00:00

真核細胞DNA序列可分1.不重複序列 占DNA總量40%~80%,750~2000bp 蛋清蛋白 蠶的絲心蛋白 血紅蛋白何珠蛋白都是單拷貝基因2. 中度重複序列3. 高度重複序列核小體單元的產生H2A H2B H3 H4 各兩分子生成的八聚體和大約200bpDNA組成,每個核小體


真核細胞DNA序列可分

1. 不重複序列 占DNA總量40%~80%,750~2000bp 蛋清蛋白 蠶的絲心蛋白 血紅蛋白何珠蛋白都是單拷貝基因

2. 中度重複序列

3. 高度重複序列

核小體單元的產生

H2A H2B H3 H4 各兩分子生成的八聚體和大約200bpDNA組成,每個核小體只有一個H1

核心顆粒包括組蛋白八聚體及與其結合的146bpDNA,該序列繞在八聚體外面1.75圈,每圈約80bp。由許多核小體構成了連續的染色質DNA細絲。


DNA:


2.3.3.2 環狀DNA雙鏈的複製

(1)θ型

(2) 滾環型(rolling circle)

(3) D-環型(D-loop)

真核生物基因組結構特點

1、真核基因組龐大,一般都遠大於原核生物的基因組。

2、真核基因組存在大量重複序列

3、真核基因組的大部分為非編碼序列,占真箇基因組序列的90%以上,該特點是真核生物與病毒和細菌之間最主要的區別。

4、真核基因組的轉錄產物是單順反子

5、真核基因組是斷裂基因,有內含子結構

6、真核基因組存在大量順式作用原件,包括啟動子、增強子、沉默子等

7、真核基因組存在大量的 DNA多態性。單核苷酸多態性、串聯重複序列多態性

8、真核基因組一般有端粒。

Tm的影響因素

(長為25mer以下的引物,Tm計算公式為:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

1)、DNA中G+C的含量,含量越高Tm值越高

2)、溶液的離子強度

3)、DNA的均一性(①DNA鹼基組成:C-G含量越多,Tm值越高;A-T含量越多,Tm值越低。

②溶液的離子強度:在低離子強度中,Tm較低,而且解鏈的溫度範圍較寬;在高離子強度中,Tm值較高,解鏈的溫度範圍較窄。

③PH值:溶液的PH值在5~9範圍內,Tm值變化不明顯,當PH>11或PH<4時,Tm值變化明顯。

④變性劑:各種變性劑主要是干擾鹼基堆積力和氫鍵的形成而降低Tm值。

⑤DNA雙鏈本身的長度。)


DNA的損傷(Mutation )

• Small-scale mutations

a. substitutation (替換、置換)

b. deletion (缺失)

c. insertion (插入)

d. exon skipping(外顯子跳躍/遺漏/跳讀)


2.5.5 SOS反應

SOS反應(SOS response)是細胞DNA受到損傷或者複製系統受到抑制的緊急情況下,細胞為求生存而產生的一種應急措施。

SOS反應包括誘導DNA損傷修復、誘變效應、細胞分裂的抑制以及溶原性細菌釋放噬菌體等,細胞的癌變也與SOS反應有關。

廣泛存在於真核和原核生物中,主要作用為:

1、DNA的修復

2、產生變異


2.7.2 SNP的檢測技術

1、基因晶片技術

2、Taqman技術

3、分子導標技術

4、焦磷酸測序法

基因作為唯一能夠自主複製、永久存在的單位,其生物學功能是以蛋白質的形式表達出來的。DNA序列是遺傳信息的貯存者,它通過自主複製得到永存,並通過轉錄生成信使RNA,翻譯生成蛋白質的過程來控制生命現象。

基因表達包括轉錄(transcription)和翻譯(translation)兩個階段轉錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同(除了T→U之外)的RNA單鏈的過程,是基因表達的核心步驟。翻譯是指以新生的mRNA為模板,把核苷酸三聯遺傳密碼子翻譯成胺基酸序列、合成多肽鏈的過程,是基因表達的最終目的。

3.1.1 RNA的結構特點

1、RNA含有核糖和嘧啶,通常是單鏈線性分子

2、RNA鏈自身摺疊形成局部雙螺旋

3、RNA可摺疊成複雜的三級結構

3、抗終止

1)破壞終止位點RNA的莖-環結構

(胺基酸濃度過低,mRNA不能形成特定的二級結構,莖-環結構被破壞。)

(2)依賴於蛋白質因子的轉錄終止

(NusA、 NusB等蛋白質結合到終止子附近,改變了聚合酶構象,使之對終止信號不敏感,績效催化RNA合成。)

真核細胞中三類RNA聚合酶特性比較

轉錄的基本過程都包括:

模板識別

轉錄起始

轉錄延伸

轉錄終止。


斷裂基因

真核基因大多是斷裂的,也就是說,一個基因可由多個內含子和外顯子間隔排列而成。研究表明,內含子在真核基因中所占的比例很高,甚至超過99%(表3-7)。

由DNA轉錄生成的原始轉錄產物——核不均一RNA

(hnRNA, heterogeneous nuclear RNA),即mRNA的前體,經過5』加「帽」和3』酶切加多聚腺苷酸,再經過RNA的剪接,編碼蛋白質的外顯子部分就連接成為一個連續的可譯框(open reading frame,ORF),通過核孔進入細胞質,作為蛋白質合成的模板。


3. 7. 3 RNA的編輯和化學修飾

RNA 的 編 輯 ( RNA editing )是某些RNA,特別是mRNA的一種加工方式,它導致了DNA所編碼的遺傳信息的改變,因為經過編輯的mRNA序列發生了不同於模板DNA的變化。

介導RNA編輯的機制有兩種:位點特異性脫氨基作用和引導RNA指導的尿嘧啶插入或者刪除。

RNA編輯的生物學意義

1)校正作用。修復突變

(2)調控翻譯。構建或者去除起始密碼子和終止密碼子,調控基因表達。

(3)擴充遺傳信息。使基因獲得新的結構和功能,有利於進化。

mRNA-蛋白質的過程

1、翻譯的起始:核糖體與mRNA結合併與氨基醯-tRNA生成起始複合物。

2、肽鏈的延伸:由於核糖體沿mRNA5』端向3』端移動,開始了從N端向C端多肽合成,這是蛋白質合成過程中速度最快的階段。

3、肽鏈的終止及釋放:核糖體從mRNA上解離,準備新一輪合成反應。

核糖體是蛋白質合成的場所, mRNA是蛋白質合成的模板,轉運RNA( tRNA )是模板與胺基酸之間的結合體。細胞中合成代謝總能量的90%消耗在蛋白質的合成過程中。

真核生物細胞核內合成的mRNA,只有被運送到細胞質基質才能被翻譯生產蛋白質。

4. 1 遺傳密碼——三聯子

所謂翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個特定的起始位點開始,按每3個核苷酸代表一個胺基酸的原則,依次合成一條多肽鏈的過程。這3個核苷酸就是一個密碼子。

翻譯從起始密碼子 AUG開始,沿mRNA 5'→3' 方向連續閱讀密碼子,直至終止密碼子為止,生成一條具有特定序列的多肽鏈-蛋白質

由一種以上密碼子編碼同一個胺基酸的現象稱為簡併(degeneracy),對應於同一胺基酸的密碼子稱為同義密碼子(synonymous codon)。AUG和GUG既是甲硫氨酸及纈氨酸的密碼子又是起始密碼子。

不同tRNA在結構上存在大量的共性,由小片段鹼基互補配對形成三葉草形分子結構,有4條根據結構或已知功能命名的手臂

不同tRNA在結構上存在大量的共性,由小片段鹼基互補配對形成三葉草形分子結構,有4條根據結構或已知功能命名的手臂

4. 2. 3 tRNA的種類

1.tRNA和延伸tRNA

2.同工tRNA

代表相同胺基酸的不同tRNA稱為同工tRNA

3.tRNA

4. 3 核糖體

核糖體是由幾十種蛋白質和多種核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)所組成的亞細胞顆粒。一個細菌細胞內約有20 000個核糖體,而真核細胞內可達106個。這些顆粒既可以游離狀態存在於細胞內,也可與內質網結合,形成微粒體。

5SrRNA 有兩個高度保守保守序列,其中一個含有CGAAC,這與tRNA的TYC環上的GTYCG序列相互作用的部位,是5s與tRNA相互識別的序列


4. 4. 6 蛋白質前體的加工

1、N端fMet或Met的切除

無論原核生物還是真核生物,N端的甲硫氨酸往往在多肽鏈合成完畢前就被切除。50%的真核蛋白中,成熟蛋白N端殘基會被N-乙基化。

2、二硫鍵的形成

mRNA中沒有胱氨酸密碼子,而不少蛋白質都含有二硫鍵。蛋白質合成後往往通過兩個半胱氨酸的氧化作用生成胱氨酸。

3、特定胺基酸的修飾

胺基酸側鏈的修飾作用包括磷酸化(如核糖體蛋白質)、糖基化(如各種糖蛋白)、甲基化(如組蛋白、肌肉蛋白質)、乙基化(如組蛋白)、羥基化(如膠原蛋白)和羧基化等,圖4-20是生物體內最普通發生修飾作用的胺基酸殘基及其修飾產物

有些蛋白質只有在另一些蛋白質存在的情況下才能正確完成摺疊過程,形成功能蛋白質。分子伴侶(molecular chaperone)在細胞中能幫助其他多肽進行正確的摺疊、組裝、運轉和降解。

兩類分子伴侶家族:

(1)熱休克蛋白(heat shock protein):它是一類應激反應性蛋白,包括HSP70、HSP40、GrpE三個家族。

(2)伴侶素:包括HSP60和HSP10(原核生物中的同源物是GroEL和GroES)


4. 4. 8 蛋白質合成抑制劑

蛋白質生物合成的抑制劑主要是一些抗生素,如嘌呤黴素、鏈黴素、四環素、氯黴素、紅黴素等。此外,5-甲基色氨酸、環已亞胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖體滅活蛋白都能抑制蛋白質的合成。

若某個蛋白質的合成和運轉是同時發生的,則屬於翻譯運轉同步機制;若蛋白質從核糖體上釋放後才發生運轉,則屬於翻譯後運轉機制

這兩種運轉方式都涉及到蛋白質分子內特定區域與細胞膜結構的相互關係。

2、前導肽的作用與性質

前導肽的特性:

帶正電荷的鹼性胺基酸(特別是精氨酸)含量較為豐富,分散於不帶電荷的胺基酸序列之間;

缺少帶負電荷的酸性胺基酸;

羥基胺基酸含量較高;有形成兩親(既有親水又有疏水部分)α-螺旋結構的能力。

4. 5. 3 核定位蛋白的運轉機制

背景:許多酶和蛋白只有在細胞核內才起作用

細胞分類,細胞核被破壞,重新形成細胞核時候,核蛋白需要歸位。

為了核蛋白的重複定位,這些蛋白質中的信號肽—被稱為核定位序列(NLS—Nuclear Localization Sequence)一般都不被切除。NLS可以位於核蛋白的任何部位。蛋白質向核內運輸過程需要核運轉因子(Importin)α、β和一個低分子量GTP酶(Ran)參與。


具備自主複製能力的DNA分子就是分子克隆的載體(vector)。病毒、噬菌體和質粒等小分子量複製子都可以作為基因導入的載體


表5-2 重組DNA實驗中常見的主要工具酶

電泳原理

一種分子被放置到電場中,它就會以一定的速度移向適當的電極。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度,叫做電泳的遷移率,它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比,與片段大小成反比。

細菌轉化:是指一種細菌菌株由於捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特徵發生遺傳改變的生命過程。

5.2.4 核苷酸序列分析(測序)

1 、Sanger 雙脫氧鏈終止法

Sanger 等人於1977 年發明了利用DNA聚合酶的雙脫氧鏈終止原理測定核苷酸序列的方法,該法有時也稱為引物合成法或酶催引物合成法

2. Maxam-Gilbert 化學修飾法

3. DNA序列分析的自動化

4. DNA 雜交測序法

5、鳥槍法(Shotgun method)

6、單分子測序

5. 2. 5 基因擴增

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術可能是體外快速擴增特定基因或者DNA序列最常用的方法

整個PCR 反應的全過程,即DNA解鏈(變性)、引物與模板DNA相結合(退火)、DNA合成(鏈的延伸)三步,可以被不斷重複。經多次循環之後,反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數,即兩條引物結合位點之間的DNA區段的拷貝數,理論上的最高值應是2n。

主要步驟:

將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫(>94 ℃)環境下加熱1 分鐘,使雙鏈DNA變性,形成單鏈模板DNA。

一般均有一個預變性的過程94℃4-5 min

實時螢光定量PCR技術(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR)是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術



cDNA末端快速擴增法(rapid amplifiation of cDNA end, RACE)是一項在已知cDNA序列基礎上克隆5』端或3』端缺失序列的技術,即在很大程度上依賴於RNA連接酶連接和寡聚帽子的快速擴增。

已知的cDNA序列可以來自序列表達標籤(EST)、減法cDNA文庫、差式顯示和基因文庫篩選。

由該片段向外進行PCR擴增得到目的序列。用於擴增5』端的方法叫做5』RACE ,用於擴增3『端的方法叫做3』RACE

5. 5. 1 質粒DNA 及其分離純化

細菌質粒是存在於細胞質中的一類獨立於染色體並能自主複製的遺傳成份,絕大多數質粒都是由環形雙鏈DNA組成的複製子

1 、pSC101 質粒載體

pSC101 質粒有可插入外源DNA的多個內切酶單克隆位點和四環素抗性強選擇記號,是第一個真核基因克隆載體。

缺點:它是一種嚴緊型複製控制的低拷貝質粒,從帶有該質粒的寄主細胞中提取pSC101 DNA,產量很低。

4 、pUC 質粒載體(包括四個部分):

(i)來自pBR322 質粒的複製起點(ori );

(ii)氨苄青黴素抗性基因(amp r );

(iii)大腸桿菌β- 半乳糖酶基因(lacZ) 的啟動子及其編碼α- 肽鏈的DNA序列,此結構特稱為lacZ』 基因;

(iv) 位於lacZ 』 基因中的靠近5』-端的一段多克隆位點(MCS)區段,外源基因插入後破壞了lacZ 』基因的功能。

4. 5. 3 λ噬菌體載體

分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。

在溶菌周期,噬菌體將其感染的寄主細胞轉變成為噬菌體的 「 製造廠」,產生出大量的子代噬菌體顆粒。將只具有溶菌生長周期的噬菌體叫作烈性噬菌體。

λ噬菌體的分子量為48.5kb,是溫和噬菌體。

λ噬菌體有61個基因,其中約一半參與了生命周期的調控,是λ噬菌體的必需基因;另一部分基因則被稱為非必需基因,被外源基因取代後不影響生命周期。

在分子生物學上,人們把將外源DNA插入具有複製能力的載體DNA中,使之得以永久保存和複製這種過程稱為克隆(clone)。


6. 1 基因表達研究技術

基因表達(gene expression)是指細胞在生命過程中,把儲存在DNA順序中遺傳信息經過轉錄和翻譯,轉變成具有生物活性的蛋白質分子。

6. 1. 2 RNA的選擇性剪接技術

RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個mRNA 前體產生不同的mRNA剪接異構體的過程。可分為:平衡剪切、5』選擇性剪切、 3』選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。常用 RT-PCR法研究某個基因是否存在選擇性剪切。

6. 1. 3 原位雜交技術

原位雜交( In Situ Hybridization ,ISH) 是用標記的核酸探針,經放射自顯影或非放射檢測體系,在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段,分為RNA和染色體原位雜交兩大類。

PCR介導的定點突變優勢

1、突變體回收率高,以至於不需要進行突變體篩選

2、能用雙鏈 DNA作為模板,可以在任何位點引入突變,

3、可在同一試管中完成所有反應

4、快速簡便,無須在噬菌體M13載體上進行分子克隆。

6. 2 基因敲除技術

6. 2. 1 基本原理

經典遺傳學(Forward genetics)是從一個突變體的表型出發,研究其基因型,進而找出該基因的編碼序列。

現代遺傳學(Reverse genetics,反向遺傳學)首先從基因序列出發,推測其表現型,進而推導出該基因的功能。

基因敲除(gene knock-out)又稱基因打靶,通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組,進行精確的定點修飾和基因改造,具有專一性強、染色DNA可與目的片段共同穩定遺傳等特點。

基因敲除分為完全基因敲除條件型基因敲除(又稱不完全基因敲除)兩種。

完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性.

條件型基因敲除是指通過定位重組系統實現特定時間和空間的基因敲除。

噬菌體的Cre/Loxp 系統、Gin/Gix系統、酵母細胞的FLP/FRT 系統和R/RS系統是現階段常用的四種定位重組系統,尤以Cre/Loxp系統應用最廣。

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