吳彥祖不輕易被定型，不論是主角配角、正派反派，都能讓觀眾對他一直保有一定的新鮮感的演員。
1974年9月30日，他出生在美國舊金山，在奧林達長大，父親是電氣工程師，母親是大學心理學教授，還有兩個姐姐。
6歲時看完功夫電影《少林寺》後，吳彥祖對武術產生了興趣，11歲拜一位北京藝人為師開始習武。高中時的吳彥祖也很叛逆，喜歡打架更甚於學習，這一切直至母親因心臟病住院才有了徹底的改變，吳彥祖白天在學校認真讀書，下課後到醫院陪母親，為此他還去學簡單的氣功療法，來輔助母親的治療。
1993年，吳彥祖在美國俄勒岡大學攻讀建築學，並獲得建築副修獎學金。1994年，吳彥祖成立了俄勒岡大學中國武術學會，並成為第一任教練。
1997年，畢業後前往香港旅行，在姐姐的建議下開始當模特。四個月後，被導演楊凡發掘，希望吳彥祖成為他的電影演員，而吳彥祖表示自己沒有表演經驗而拒絕。而楊凡則天天給吳彥祖打電話，終於說服了他。
因此在1998年拍了首部個人電影作品《美少年之戀》，憑藉該片獲得第18屆香港電影金像獎最佳新演員。
2010年4月6日，吳彥祖與相戀8年的女友在南非舉行婚禮，此後吳彥祖逐漸淡出演藝圈，但是他的名字，已經變成描述男人帥氣的特定形容詞了。