2019年12月下旬，武漢不明原因肺炎爆發。2020年1月2日，武漢病毒所確定了新型冠狀病毒全基因組序列，並於1月5日成功分離到了病毒毒株。1月23日，武漢病毒所石正麗團隊在bioRxiv預印版平台上發表文章，提出新型肺炎病毒或來源於蝙蝠，並發現新型冠狀病毒與一種蝙蝠的冠狀病毒的序列一致性高達96%。但對於新型冠狀病毒的真正宿主尚未定論。
2020年1月30日，中國疾病預防控制中心國家病毒性疾病預防控制所生物安全重點實驗室譚文杰教授和山東省高等學校新發傳染病病因流行病學實驗室主任譚文杰教授就2019-nCoV的基因組特徵和流行病學在《柳葉刀》發表題為「Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding」的文章，描述了2019-nCoV的全基因組特徵以及與其他冠狀病毒的相似性和差異，包括引起2002-2003年嚴重急性呼吸道綜合症的SARS病毒。研究發現，來源於9例早期患者樣本的2019-nCoV基因組序列在遺傳上幾乎是相同的，這表明這種病毒是最近才在人類中出現的，而且發現疫情的速度相對較快。目前數據表明，2019-nCoV與蝙蝠來源的其他β冠狀病毒關係密切，這些動物可能是這種新型病毒病原體的宿主，但可能存在目前未知的動物充當了蝙蝠和人類之間的中間宿主。
背景
2019年12月下旬，中國武漢報導了因不明微生物病原體導致的病毒性肺炎患者。隨後鑑定出一種新型冠狀病毒為病原體，臨時命名為2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）。截至2020年1月26日，已經確診了2000多例2019-nCoV感染病例，其中大多數生活在武漢或有武漢訪問史，並且已經確認了人傳人。
方法
我們使用下一代測序技術對9例住院患者的支氣管肺泡灌洗液和分離物培養樣品進行了檢測，其中8例曾去過武漢華南海鮮市場。從這些個體獲得了完整或部分2019-nCoV基因組序列。利用Sanger測序連接病毒重疊群以獲得全長基因組，通過快速擴增cDNA末端確定其末端區域。對2019-nCoV基因組與其他冠狀病毒基因組進行了系統進化分析，以確定該病毒的進化史並推斷其可能的起源。同源建模以研究病毒可能的受體結合特性。
發現
從9位患者獲得的10條2019-nCoV基因組序列極其相似，序列同源性超過99.98％。值得注意的是，2019-nCoV與2018年在中國東部舟山採集的兩種蝙蝠源性嚴重急性呼吸綜合徵（SARS）樣冠狀病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21密切相關（同源性為88％），但與SARS-CoV（約79％）和MERS-CoV（約50％）距離更遠。系統發育分析表明，2019-nCoV屬於β冠狀病毒屬的Sarbecovirus亞型，與最接近的親屬bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21分支長度相對較長，且在遺傳上與SARS-CoV不同。值得注意的是，同源性建模顯示，2019-nCoV與SARS-CoV有類似的受體結合結構域結構，除了某些關鍵殘基處的胺基酸差異。
解釋
2019-nCoV與SARS-CoV差異很大，可被認為是一種新型人類感染性β冠狀病毒。儘管系統發育分析表明，蝙蝠可能是該病毒的原始宿主，但武漢華南海鮮市場上出售的動物可能是向人傳播該病毒的中間宿主。重要的是，結構分析表明2019-nCoV可能與人類血管緊張素轉化酶2受體結合。該病毒的未來進化、適應性和傳播亟需進一步研究。
引言
冠狀病毒科的病毒具有單鏈、正義RNA基因組，長度從26到32kb不等。已經在幾種鳥類及各種哺乳動物中鑑定出冠狀病毒，包括駱駝、蝙蝠、蒙面棕櫚果子狸、老鼠、狗和貓。經常在哺乳動物中鑑定出新型冠狀病毒，如源於蝙蝠的HKU2相關冠狀病毒導致2018年豬的致命急性腹瀉綜合徵。
在幾種對人有致病性的冠狀病毒中，大多數是輕度臨床症狀，但有兩個例外值得注意：嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒（SARS-CoV）（一種新型β冠狀病毒，2002年11月在中國廣東出現，並在2002-2003年間造成37個國家/地區8000多例感染、774例死亡）和中東呼吸綜合徵冠狀病毒（MERS-CoV）（2012年在沙烏地阿拉伯首次發現，自2012年9月以來，共造成2494例實驗室確診感染病例和858例死亡，其中韓國38例輸入性感染死亡）。
2019年12月下旬，在中國湖北省武漢市華南海鮮市場上發現了幾例病毒性肺炎的流行病學病例。在此之前，鳥類和兔子等許多非水生動物也在此出售。使用下一代測序技術鑑定出一種可感染人的新型冠狀病毒，臨時命名為2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）。截至2020年1月28日，中國報告了33個中國省、直轄市5900例確診和9000例疑似2019-nCoV感染病例，死亡106例。此外，泰國、日本、韓國、馬來西亞、新加坡和美國也報導了2019-nCoV。還報告了醫務人員和家庭聚集性感染，並已確認人際傳播。大多數感染者發高燒，有些呼吸困難，胸部X光片顯示雙肺都有浸潤性病變。
我們報告來自武漢市至少三家醫院的9名被診斷出原因不明的病毒性肺炎的住院病人的流行病學數據。利用下一代測序檢測這些患者的支氣管肺泡灌洗液和分離物培養樣本，發現了2019-nCoV。我們描述了這種新型病毒的10條基因組的基因組特徵，提供了有關病毒起源和細胞受體結合的重要信息。
結果
從分析的9位患者樣本中，獲得了8條完整和2條部分2019-nCoV基因組序列。這些數據已保存在中國國家微生物數據中心（登錄號NMDC10013002，基因組登錄號NMDC60013002-01至NMDC60013002-10），而BGI的數據已保存在中國國家基因庫（登錄號CNA0007332–35）。
基於這些基因組，我們開發了一種實時PCR檢測方法，並再次檢測了BGI的原始臨床樣品（WH01、WH02、WH03和WH04），以確定其閾值循環（Ct）值。其餘樣品通過中國疾病預防控制中心開發的實時螢光定量PCR檢測，Ct值範圍為22.85至32.41。這些結果證實了患者中存在2019-nCoV。
9例患者的支氣管肺泡灌洗液或培養的病毒樣本用於下一代測序。除去宿主（人類）接頭後，進行從頭組裝獲得重疊群以檢索非冗餘蛋白質資料庫。所有樣品中鑑定出的重疊群均與蝙蝠SARS樣β冠狀病毒bat-SL-CoVZC45密切相關。然後，將Bat-SL-CoVZC45作為參考基因組，並將每個池中的reads映射到其上，從而產生所有池的共有序列。然後將這些共有序列作為新的參考基因組，獲得了八條完整基因組和兩條部分基因組（來自樣品WH19002和WH02）。從所有池中獲得的clean reads的從頭組裝沒有識別出其他任何長片段與其他高豐度病毒相對應。
8條完整的基因組在整個基因組中幾乎是相同的，序列同源性超過99.98％，表明最近才出現在人類群體中（圖1A）。最大的核苷酸差異是四個突變。值得注意的是，來自同一患者的兩個病毒基因組（來自支氣管肺泡灌洗液的WH19001和來自細胞培養的WH19005）之間的序列同源性超過99.99％，在胺基酸水平上具有100％的同源性。另外，來自WH02和WH19002樣品的部分基因組與完整基因組中對齊的基因區域具有近100％的同源性。
對2019-nCoV完整基因組進行Blastn檢索顯示，GenBank上最相關的病毒是bat-SL-CoVZC45（序列同源性87.99％；覆蓋率99％）和另一種蝙蝠起源的SARS樣β冠狀病毒bat-SL-CoVZXC21（登錄號MG772934；序列同源性87.23％；覆蓋率98％）。在五個基因區域（E，M，7，N和14）中，序列同源性大於90％，其中E基因最高（98.7％）（圖2A）。2019-nCoV的S基因與bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21的序列同源性最低，僅為75％左右。此外，1b的序列同源性（約86％）低於1a（約90％；圖2A）。2019-nCoV和相關蝙蝠衍生冠狀病毒在大多數編碼蛋白間序列同源性高（圖2a）。刺突蛋白是例外，僅約80％的序列同源性；蛋白13有73.2％的序列同源性。值得注意的是，2019-nCoV與SARS-CoV（約79％）和MERS-CoV（約50％）遺傳相似性低。利用SimPlot軟體可視化2019-nCoV與相關病毒間的相似性，並以2019-nCoV共有序列作為查詢（圖2B）。
將2019-nCoV的預測編碼區進行比較，發現其與bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21和SARS-CoV基因組結構相似(圖1B)。至少預測了12個編碼區域，包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13和14(圖1B)。2019-nCoV、bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21編碼的大部分蛋白長度相似，只有少量的插入或缺失。一個顯著的區別是，與蝙蝠樣SARS冠狀病毒、SARS-CoV和MERS-CoV相比，2019-nCoV編碼的刺突蛋白更長(圖1B)。
對2019-nCoV及其密切相關的參考基因組以及代表性冠狀病毒進行系統發育分析，發現這5個亞屬形成了5個分支（圖3）。Sarbecovirus亞屬可以分為三個進化支：來自保加利亞（登錄號GU190215）和肯亞（KY352407）的Rhinolophus sp來源的兩種SARS-CoV相關菌株形成了進化枝1；來自武漢的十個2019-nCoV和來自中國東部舟山的兩個蝙蝠衍生的SARS樣菌株（bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21）形成了進化枝2，該分支以區分人和蝙蝠病毒而著名；來自人類的SARS-CoV以及從中國西南地區收集到的許多基因相似的SARS樣冠狀病毒形成進化枝3，蝙蝠衍生的冠狀病毒也位於基底位置（圖3）。此外，2019-nCoV在RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）基因與SARS-CoV系統發育截然不同。該證據表明2019-nCoV是一種來自Sarbecovirus亞屬的新型β冠狀病毒。
由於序列相似性圖揭示了2019-nCoV基因組間遺傳距離的變化，因此我們對Sarbecovirus亞屬代表性成員的主要編碼區進行了系統進化分析。與基因組系統發育一致，2019-nCoV、bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21聚類在1a和刺突基因。相比之下，2019-nCoV與bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21並未在1b樹中聚類，而是與SARS-CoV、bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21形成了獨特的進化枝，暗示了1b潛在的重組事件，儘管這可能在蝙蝠冠狀病毒發生而非2019-nCoV中。對2019-nCoV基因組（不包括1b）的系統進化分析顯示，與全長病毒基因組具有相似的進化關係。
包膜刺突蛋白（S）介導受體結合和膜融合，對於確定宿主向性和傳播能力至關重要。通常，冠狀病毒的刺突蛋白在功能上分為負責受體結合的S1結構域（特別是SARS-CoV的318-510位）和負責細胞膜融合的S2結構域。2019-nCoV S2蛋白與bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21具有約93％的序列同源性，遠高於 S1結構域，與蝙蝠來源的病毒僅有約68％的同源性。S1結構域的N端和C端都可以與宿主受體結合。我們研究了Sarbecovirus冠狀病毒中刺突蛋白的胺基酸變化（圖4）。儘管2019-nCoV和SARS-CoV屬於不同的進化枝（圖3），但它們在S1結構域仍有約50個保守胺基酸，然而在大多數蝙蝠衍生病毒中表現出突變差異（圖4）。這些位置大多數位於C端結構域中（圖4）。 此外，在蝙蝠衍生的病毒中發現了許多缺失突變，包括455-457、463-464和485-497位缺失（圖4）。
β冠狀病毒直接與受體結合的結構域通常位於S1的C末端，如B型SARS-CoV和C型MERS-CoV和BatCoV HKU4（圖5）。通過對不同譜系的四種冠狀病毒的受體結合域系統發育分析發現，儘管在全基因組水平上2019-nCoV更接近bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21，2019-nCoV的受體結合域屬於B型，更接近SARS-CoV的受體結合域（圖5A）。使用Swiss-Model程序以SARS-CoV受體結合結構域結構（Protein Data Bank ID 2DD8）為模板對2019-nCoV受體結合結構域的三維結構建模。分析表明，與其他β-冠狀病毒一樣，受體結合結構域由核心和外部亞結構域組成（圖5B–D）。值得注意的是，2019-nCoV受體結合結構域的外部亞結構域與SARS-CoV更相似。該結果表明，2019-nCoV也可能以血管緊張素轉化酶2（ACE2）作為細胞受體。但是，我們還觀察到，2019-nCoV受體結合域中負責與ACE2受體結合的幾個關鍵殘基是可變的（包括Asn439、Asn501、Gln493、Gly485和Phe486）。
討論
從中國武漢市病毒性肺炎患者臨床樣品的基因組監測中，鑑定出一種新型冠狀病毒（稱為2019-nCoV）。我們對9例患者樣品的2019-nCoV進行系統發育分析，結果表明該病毒屬於Sarbecovirus屬。與已知的人類感染冠狀病毒（包括2003年爆發的SARS病毒）相比，2019-nCoV與兩種蝙蝠衍生的冠狀病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21更相似。
從流行病學角度看，我們研究的9例患者中有8例曾與武漢華南海鮮市場接觸過，這表明他們可能與該市場的傳染源有過密切接觸。然而，儘管有一例患者在疾病發作之前就住在市場附近的一家旅館裡，但從未去過市場，可能通過飛沫傳播或被當前未知來源感染。現在，家庭成員和醫務人員的聚集性感染證實了人與人之間的傳播。顯然，這種感染是主要的公共衛生問題，特別是暴發恰逢中國春節旅遊高峰期，成千上萬人將穿越中國。
作為一種典型的RNA病毒，冠狀病毒的平均進化速率約為每年每個位點10E–4個核苷酸替換，在每個複製周期中都可能發生突變。令人驚訝的是，此處描述的來自不同患者的2019-nCoV序列幾乎相同，具有大於99.9％的序列同源性。這表明，2019-nCoV在短時間內只有一個來源，並且被相對迅速地檢測到。但是，隨著病毒傳播給更多的人，需要不斷監測所產生的突變。
系統發育分析表明，蝙蝠源冠狀病毒屬於β冠狀病毒屬的所有五個亞屬。此外，蝙蝠來源的冠狀病毒在Sarbecovirus亞屬中處於基礎位置，其中2019-nCoV與從蝙蝠身上取樣的bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21密切相關。這些數據與蝙蝠冠狀病毒一致，特別是2019-nCoV。然而，儘管蝙蝠很重要，但一些事實表明另一種動物正在充當蝙蝠與人之間的中間宿主。首先，該暴發於2019年12月下旬首次報導，當時武漢大多數蝙蝠物種正在冬眠。其次，在華南海鮮市場上沒有出售或發現蝙蝠，而有各種非水生動物（包括哺乳動物）可供購買。第三，2019-nCoV與其近親bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21之間的序列同源性小於90％，這表明在它們在相對較長的分支上。 因此，bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21不是2019-nCoV的直接祖先。第四，在SARS-CoV和MERS-CoV中，蝙蝠都充當天然宿主，另一種動物（SARS-CoV——蒙面棕櫚果子狸；MERS-CoV——單峰駱駝）作為中間宿主，人類為最終宿主。因此，根據目前數據，造成武漢爆發的2019-nCoV病毒的宿主最初可能是蝙蝠，通過在華南海鮮市場出售的目前未知的野生動物傳播給了人類。
先前的研究已經發現了幾種冠狀病毒可以結合的受體，例如SARS-CoV的ACE2和MERS-CoV的CD26。我們的分子模型顯示SARS-CoV的受體結合域與2019-nCoV相似。因此，儘管2019-nCoV受體結合域中存在胺基酸突變，我們認為2019-nCoV可能使用ACE2作為受體。儘管先前使用表達ACE2蛋白的HeLa細胞研究表明2019-nCoV可以使用ACE2受體，但這些突變是否影響ACE2結合或改變受體向性仍需要進一步研究。
在冠狀病毒中經常出現重組。正如預期所料，我們在Sarbecoviruses中檢測到重組。我們的結果表明重組事件很複雜，與2019-nCoV相比，蝙蝠冠狀病毒更可能發生重組事件。因此，儘管發生了重組，但重組可能不是該病毒出現的原因，如果鑑定出更相關的動物病毒，這一推斷可能會改變。
總之，我們已經描述了第七種可以引起嚴重肺炎的人類冠狀病毒的基因組結構，並闡明它的起源和受體結合特性。更普遍的是，與2019-nCoV相關的疾病暴發再次凸顯了野生動物中隱藏的病毒庫以及它們偶爾向人類擴散的潛力。
本文參考文獻：Lu R, Zhao X, Li Jet al.Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding[J].The Lancet, 2020.
原文連結：https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8