心肌細胞程序性壞死——心臟疾病防治的新靶點
Programmed necrosis of cardiomyocytes--new preventive and therapeutic target
李靖南 張俊霞 張岩
作者單位：110001 瀋陽，中國醫科大學；100871 北京大學膜生物學國家重點實驗室，分子醫學研究所
通信作者：張岩，電子信箱：zhangyan9876@pku.edu.cn
心肌細胞是終末分化細胞，再生能力非常有限。很多損傷因素都會引起心肌細胞過度死亡，而死亡的心肌細胞無法得到有效的補充，會引起心臟功能單位的永久性喪失，進而導致包括心肌梗死、惡性心律失常、心力衰竭和心原性猝死等多種心臟疾病的發生[1]。因此，闡明心臟細胞死亡的機制、確定干預方法，對減少心肌細胞死亡和防治心臟疾病具有重要意義。
在過去的幾十年里，由於細胞凋亡(apoptosis)被認為是唯一一種受調控的細胞死亡方式，大多數關於細胞死亡的工作都集中於細胞凋亡。而細胞壞死(necrosis)由於被認為是"不受管制的"或"偶然發生的"，因此雖然細胞壞死是多種心臟病變的主要病理特徵之一[2]，其作用被完全忽略。然而，近年來這一觀念逐漸受到了挑戰，即細胞壞死很可能也是一種可調控的死亡方式，至少一部分細胞壞死是可以調控的，稱為程序性壞死(programmed necrosis)[3,4]。對這些過程的遺傳和生化分析表明，壞死取決於引發死亡的刺激，而且是由適當的機制組織和執行的，而不是簡單的無序過程。最近的研究結果表明，程序性壞死在包括心臟在內的多種器官和組織的病生理過程是存在的，並發揮重要作用[2,5]，此外還有一些與程序性壞死的形態學定義相一致的細胞死亡類型，包括焦亡(pyroptosisi)、鐵死亡(ferroptosis)等。本綜述關注於心肌細胞程序性壞死的調控機制，及其病理意義方面取得的最新進展，尤其是在心臟疾病防治中的潛在價值。
心肌細胞程序性壞死的機制
1.1 線粒體與心肌細胞程序性壞死
線粒體是細胞重要的產能細胞器，也參與細胞的程序性壞死的調節。健康的線粒體內膜(inner mitochondrial membrane，IMM)不會被小分子甚至質子滲透，導致膜間隙和線粒體基質之間存在化學梯度和電梯度。這些梯度對於呼吸過程中將二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)轉化為三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)是必需的[6]。因此，維持IMM的完整性是保持線粒體正常功能的關鍵。與細胞凋亡過程中發生的線粒體外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)失衡不同，細胞壞死通常會破壞IMM，從而導致線粒體滲透壓孔道(mitochondria permeability transition pores，mPTPs)的開放。
腺嘌呤核苷酸轉位酶(adenine nucleotide translocase，ANT)、電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)、親環素D(cyclophilin D, CypD，一種肽基脯氨醯–順反異構酶)和IMM中的磷酸鹽載體(phosphate carrier，PiC)、以及在OMM中的外周苯並二氮受體(peripheral benzodiazepine recepter，PBR)和己糖激酶(hexokinase，HK)，被認為是mPTPs的組成成分。然而，mPTPs的確切成分尚未確定。ANT在mPTPs中的作用，是由受腺嘌呤核苷酸與ANT結合引起的Ca2＋誘導mPTP開放的敏感性降低所證實的。相反，通過遺傳學手段，卻發現ANT對mPTP功能並非是必需的。因此，ANT可能並不是mPTPs的一個關鍵組分，而只是發揮調節作用。VDAC是OMM中最豐富的蛋白，它能與ANT被共同純化出來，推測這兩種蛋白可以在OMM和IMM之間的接觸位點相互作用。然而，Ca2＋和氧化應激誘導的mPTP開放並不受三種小鼠VDAC基因(VDAC1、VDAC2和VDAC3)全部缺失的影響，說明VDAC對於mPTP的功能也不是必需的。由Ppif基因編碼的CypD是位於線粒體基質中的肽基脯氨醯—順反異構酶。CypD的缺失在體外和體內都能保護細胞壞死，而CypD過度表達的作用則正好相反[2,5]，表明CypD是mPTP和壞死的關鍵調節因子。然而在CypD缺失的情況mPTP依然能夠開放，說明其也不是mPTP必需的結構組分。
啟動mPTPs的主要原因是線粒體基質Ca2＋濃度升高和氧化應激。最近，利用雙敲除實驗發現，促凋亡蛋白Bax和Bak參與調節mPTP的功能和細胞過程[7]。研究表明，PI3K/Akt/FoxO3a/Bnip3L通路在過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)引起的H9C2心肌細胞壞死和線粒體功能障礙中起重要作用。隨後，激活的Bnip3被證明能夠作用於線粒體，引起線粒體碎裂、線粒體自噬和壞死。
mPTP的開放有幾個直接的後果，包括呼吸驅動的ATP合成停止、由於線粒體膜電位(ΔΨm)的崩潰，使FoF1-ATP合成酶活性反轉、溶質和離子在IMM上的再分布，由於大量的水進入富溶質基質而造成的滲透壓梯度破壞。水的進入導致線粒體基質膨脹和IMM的擴張。而由於與OMM不同，IMM具有冗餘性，不易破裂，因此線粒體基質擴張會導致OMM破裂，使凋亡刺激因子(即細胞色素C)釋放到胞漿中。凋亡刺激因子的釋放會觸發凋亡小體組裝和caspase的激活[5]。最近還有研究發現脂質過氧化也是mPTPs開放和氧化應激導致細胞壞死的重要因素。此外，mPTPs的開放導致ATP水平降低。雖然嚴重的ATP耗竭和細胞膜完整性的喪失是壞死時細胞死亡的主要原因，但下游凋亡信號的激活也對此有貢獻[6]。
最近的研究表明，"線粒體蛋白激酶"，如蛋白激酶B，蛋白激酶C，細胞外調節激酶，糖原合成酶激酶3β和己糖激酶Ⅰ、Ⅱ等，除了分布於胞漿以外，也在線粒體內有分布，能夠接收細胞內分子的信號，從而決定細胞的死亡或存活。這些激酶通過相互之間，以及與mPTP組分之間形成複合物，進而調節mPTP的開放。
1.2 死亡受體依賴的心肌細胞程序性壞死
研究表明，在某些類型的細胞中，在細胞凋亡受抑制的情況下(即抑制caspase)，激活死亡受體刺激依然能誘導細胞死亡，此種細胞死亡具有細胞壞死的形態學特徵，提示程序性壞死的存在[8]。2005年，此種細胞壞死被Degterev等[6]命名為"程序性壞死"。最近的數據還顯示，激活通常引起凋亡的死亡受體，如腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor recepter，TNFR，包括TNFR1和TNFR2)、TNF相關的凋亡誘導配體和Fas配體受體，也可以引發細胞程序性壞死。在這些受體中，TNFR1是被研究最為透徹的。TNF與TNFR1的結合促進了複合物I的形成，其中還包括通過死亡域相關的TNF受體超家族1A(TRADD)修飾因子，受體相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1，RIP1)、TNF受體相關因子2(TNF receptor associated factor 2，TRAF2)和凋亡抑制蛋白cIAP1和cIAP2，它們能夠通過活化NF-κB，進而引起多種促細胞生存基因的表達[9]。複合物I通過一系列的變化轉化為複合物II，其中包括複合體I的內吞、TNFR1的解離、CYLD和A20引起的RIP1去泛素化，以及Fas相關死亡域蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)和caspase-8的聚集。如果caspase-8不被抑制，它可以切割RIP1，從而刺激多個存活基因的表達；這種刺激在活性氧(reactive oxygen specie，ROS)存在的情況下會增強[10]。在TNF/z-VADfmk誘導的程序性壞死信號通路中，RIP1/RIP3複合物似乎並不是必需的，一些與RIP1-RIP3平行的其他可能通路也可能同樣重要。
確定程序性壞死啟動以後的下游事件對明確細胞壞死的過程、並相應的研發乾預策略非常重要。雖然對RIP1和RIP3的下游事件尚不完全清楚，但已有的研究發現混合譜系激酶樣蛋白(Mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)的磷酸化[11]，磷酸甘酸變位酶5(phosphoglycerate mutase 5, PGAM5，線粒體磷酸酶)[12]和某些分解酶(谷氨酸脫氫酶1，谷氨酸氨連接酶和糖原磷酸化酶)等是其重要的下游分子。最後一個信號通過ROS的產生引起死亡[10]。其它涉及壞死的下游事件包括鈣蛋白酶、磷脂酶、脂氧合酶和鞘磷脂酶的激活和溶酶體LX的通透。然而也有研究顯示，抑制PGAM5及其下游Drp1對TNF誘導的小鼠成纖維細胞程序性壞死無明顯保護作用，提示RIP1/RIP3/MLKL壞死複合物的下游效應通路可能存在物種和細胞特異性。
其他形式的心肌細胞程序性死亡或類似壞死的細胞死亡
除了上面提到的程序性壞死形式以外，近年來其他幾種具有細胞壞死特徵的心肌細胞死亡方式，包括RIP3/Ca2＋-鈣及鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)介導的心肌細胞壞死[13]、焦亡[14]和鐵死亡[15]等，也被證明在包括心血管疾病在內的多種疾病過程中發揮作用。
心肌細胞程序性壞死與心臟疾病
細胞死亡，尤其是心肌細胞死亡，是多種心臟疾病的重要機制[16]。各種心臟疾病中心肌細胞死亡的程度、時程和動力學存在著明顯的差異。例如，心肌梗死的特點是在缺血後24小時內出現大量的心肌細胞死亡。相反，心力衰竭會導致持續數月至數年的心肌細胞死亡，其水平雖然較低，但仍比健康人高100倍[17]。由於最近大量的研究表明，不僅細胞凋亡，細胞壞死也受到嚴格調控，使人們對可控性細胞死亡在心臟疾病中的作用重新產生興趣。
3.1 心肌缺血損傷
心肌梗死是缺血性心臟病/冠狀動脈疾病的常見表現，是世界範圍內死亡的主要原因。防治心臟缺血損傷的最佳方法是恢復心肌組織的血流，即再灌注。然而，心臟再灌注治療可引起心肌細胞的另一種損傷，即缺血/再灌注損傷。在臨床治療中，壞死一直被認為是心肌梗死和缺血/再灌過程中的主要心肌細胞死亡類型。而且程序性壞死已被證實在兩種心臟損傷的發展中起著關鍵的作用。
心肌缺血導致的心肌梗死與細胞壞死之間最緊密的聯繫是mPTP。缺血導致缺氧、無氧代謝和細胞內酸中毒。作為對酸中毒的反應，Na＋/H＋交換器將H＋泵出細胞，從而使細胞內[Na＋]大量增加。進而由Na＋/Ca2＋交換泵處理過量的Na＋，細胞內[Ca2＋]水平隨之升高。胞內[Ca2＋]的進一步升高是由於Ca2＋誘導內質網/肌漿網的鈣釋放和再灌注[18]。這些活動中的每一項都有助於啟動mPTP。CypD是mPTPs的重要正調節因子。缺乏CypD的細胞對氧化應激/Ca2＋誘導的細胞死亡具有抗性，但對凋亡刺激敏感。CypD基因缺失和藥理抑制均能減少對缺血/再灌小鼠梗死面積的影響[2,5]。
雖然RIP1/RIP3信號的細節仍不清楚，但RIP1的低分子量抑制劑Necrostatin-1在體內縮小了因缺血/再灌而梗死的範圍。有趣的是，Necrostatin-1的心臟保護作用依賴於CypD的存在，提示RIP1與線粒體壞死有關。雖然這種潛在聯繫的分子機制仍不清楚，RIP3在壞死期間激活代謝途徑導致ROS的產生是一個可能的解釋。由於RIP3-CaMKⅡ-mPTP心肌壞死通路的抑制，選擇性抑制劑KN-93對CaMKⅡ的抑制對缺血/再灌誘導的心肌梗死和壞死有明顯的抑制作用[13]。綜上所述，這些研究再次證明，除了凋亡，壞死也參與了心肌梗死的發病機制。
最近，Bax和Bak這兩種細胞凋亡的生物標誌物也被證明對壞死有調節作用。Bax和Bak的缺失可明顯減輕缺血/再灌所致的心臟壞死。這些作用很可能是通過與Bax和Bak對細胞凋亡的調節不同的途徑產生影響，如介導凋亡的關鍵位點突變的Bax突變體仍然能夠介導細胞壞死。此外，缺氧/復氧治療對原代大鼠心肌細胞缺血/再灌損傷的影響的研究顯示，熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP 70)通過抑制心肌缺血/再灌注過程中的自噬作用，下調心肌細胞的壞死，揭示了HSP 70新的蛋白機制，並且進一步證實了可控性細胞壞死與缺血/再灌損傷的關係。
目前，microRNAs(miR)也被證明能夠在缺血/再灌引起的程序性壞死中發揮調節作用。已有報導顯示miR-223 KO小鼠中程序性壞死相關的蛋白表達上升，而其轉基因小鼠則相反，而且miR-223的變化與心臟對缺血/再灌引起的程序性壞死的抵抗力有關。此外，兩種能夠引起細胞程序性壞死的死亡受體(TNFR1和死亡受體6)[19]是miR-223的靶點。
3.2 心力衰竭
心力衰竭是一種由於心臟泵血無法滿足身體的需要而引起的臨床綜合徵。心肌梗死是引起心力衰竭的最常見的原因之一。進行性的心肌細胞損失和心臟功能障礙是心力衰竭的重要特徵。雖然對壞死細胞的明確鑑定仍有疑問，但與對照組相比，心力衰竭心臟心肌細胞壞死率明顯升高，且似乎超過了凋亡比率，這在早期的研究中被證明是導致細胞在終末期心力衰竭死亡的關鍵因素之一。
在心力衰竭與壞死的關係中，Ca2＋處理和mPTP開放可能是關鍵因素。心肌細胞中L型鈣通道β2a亞基的過表達，能夠導致細胞內鈣超載、心肌細胞壞死和心力衰竭。重要的是，CypD的缺失而不是Bcl-2的過表達能夠挽救這種表型。同樣，阿黴素所致的心肌病也能通過剔除肽類醯脯氨酸異構酶F而得到改善。在壓力/體積超負荷引起的心力衰竭中，TNFR1相關的程序性壞死通過促進促炎基因的表達，包括編碼腫瘤壞死因子等來發揮作用。心力衰竭組RIP1、磷酸化和總RIP3、以及MLKL的水平均高於對照組；另一方面，RIP3和磷酸化MLKL的亞細胞定位與死亡信號的激活是一致的。
儘管上述證據表明壞死可能參與了人類心力衰竭和擴張型心肌病的發展。與心肌梗死相比，程序性壞死在心力衰竭中的作用仍然缺乏決定性證據，心力衰竭心臟中心肌細胞壞死的程度及對此綜合徵發病機制的普遍適用性，還需要在今後的工作中加以論述。
結論
人們對細胞壞死的可控性的認識的加深，對許多不同的科學和醫學領域都產生了影響。首先，這種認識提出了關於細胞壞死的生理作用，壞死和其他死亡過程之間的分子聯繫，以及各種細胞死亡形式之間的進化關係的問題。此外，來自體內和體外研究的越來越多的證據表明，心臟細胞死亡在心臟疾病的發病機制中起著重要的作用。因此，儘管還有一些問題仍未被解決，但是可控性心肌細胞壞死為心臟疾病的防治開闢了一個嶄新的方向。未來的研究旨在發現程序性死亡信號的新成分和調控機制。此外，高特異性、低毒、更適合臨床應用的新抑制劑開發的轉化醫學研究也是必要的。
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本文來源
李靖南, 張俊霞, 張岩. 心肌細胞程序性壞死——心臟疾病防治的新靶點[J]. 中國心血管雜誌, 2019, 24(5): 404-407. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5410.2019.05.003.