病毒宏基因組學揭示馬來亞穿山甲受仙台病毒和冠狀病毒的侵染
Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica)【1】
Impact Factor：3.811【3】
https://doi.org/10.3390/v11110979
發表日期：2019-10-24
第一作者：Ping Liu 1
通訊作者：Jin-Ping Chen 1,*chenjp@giabr.gd.cn
合作作者：Wu Chen 2
主要單位：
1廣東省應用生物資源研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室(Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangzhou 510260, China)
2廣州動物園(Guangzhou Zoo, Guangzhou 510230, China)
寫在前面
2020年2月7日上午11時，華南農業大學針對新型冠狀病毒肺炎疫情研究攻關情況舉行了新聞發布會。華南農業大學、嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室教授沈永義、肖立華等科研人員，通過聯合攻關，在新型冠狀病毒潛在中間宿主的溯源上取得突破。他們的最新研究表明，穿山甲為新型冠狀病毒的潛在中間宿主。
由於相關論文並未發表或提交到預印本雜誌，更多的細節無從知曉。本文章通過解讀2019年10月24日發表的一篇採用宏基因組學技術揭示穿山甲與冠狀病毒相關的一篇文章，來提供一些更詳細且可能相關的信息。【2】
摘要
穿山甲是一種亟須保護的瀕危動物。識別和編目穿山甲攜帶的病毒是評估潛在病原體範圍和幫助保護的一種合理方法。本研究為了解馬來亞穿山甲的病毒群落以及馬來亞穿山甲與其他宿主間優勢致病性病毒的分子流行病學提供了依據。通過從頭拼接的方法構建的contigs數目共62,508個，BLAST搜索發現其中3600個(≥300 nt)與病毒序列相關，其中68個contigs與已知病毒序列高度相似，主要的病毒為仙台病毒和冠狀病毒。這是關於穿山甲病毒多樣性的第一份報告，擴展了我們對瀕危物種病毒組的理解，並提供了對病毒整體多樣性的洞察，這些病毒可能直接或間接地跨種傳播到其他哺乳動物。
前言
馬來亞穿山甲(Manis javanica)是一種典型的哺乳類動物，是世界上僅有的八種穿山甲之一。其中四種來自亞洲M. javanica, M. pentadactyla, M. crassicaudata 和 M. culionensis，其餘四種主要來自非洲(M. tricuspis, M. tetradactyla, M. gigantea and M. temminckii)。與其他胎盤哺乳動物不同，穿山甲皮膚上覆蓋著大量重疊的角化鱗片。其肉質美味和藥用價值使其成為世界上偷獵和販運最多的哺乳動物。這就是為什麼所有八種穿山甲都包括在《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)中。由於這些瀕危物種的生存狀況和野生種群數量的持續下降，中國已經採取了協調一致的措施來保護和拯救圈養的這些物種。同時，健康狀況不佳、免疫力低下也是穿山甲搶救面臨的重要問題。已有報導從穿山甲身上獲得了副流感病毒5的完整基因組序列，暗示穿山甲除了面臨人類的傷害，還面臨傳染病的風險。近年來，大量的病毒宏基因組學研究發現了人、豬、牛、蝙蝠、貓、馬、雞等動物攜帶的致病病毒，其中一些成功地分離出了新的病毒株。然而，我們對穿山甲等珍稀瀕危陸生脊椎動物的疾病及其病因仍知之甚少。
病毒是一種只在活細胞內進行複製的傳染媒介，有能力感染多種宿主。關於確定病毒感染性、致病性和對宿主微生物群影響的最佳方法，病毒學學界進行了大量討論。病毒學家使用多種方法來了解感染、複製、致病性，以及最近病毒基因組的進化。環境樣品中核酸的無偏測序（宏病毒組=宏基因組+宏轉錄組）在發現和鑑定各種微生物方面具有巨大的潛力。我們將這種技術稱為宏基因組學，或隨機或鳥槍法高通量測序。從理論上講，宏基因組學技術使樣品中所有微生物的鑑定和基因組鑑定成為可能。隨著新一代測序(NGS)方法的引入，這種方法越來越受歡迎。與以前的測序技術相比，新一代測序方法可以在更短的時間內以更低的成本提供更多的數據。雖然最初主要應用於細菌多樣性分析，但樣品製備方案的修改也允許對病毒基因組進行表征。科研人員已經抓住機會，擴大了我們在病毒發現和生物多樣性表征領域的知識。
2019年3月24日，廣東省野生動物救助中心從海關緝私局接收了21隻活馬來亞穿山甲; 大多數個體健康狀況不佳，身體布滿了皮疹，其中包括成年和亞成年個體。所有這些馬來亞穿山甲都是由廣東野生動物救助中心救助的，但經過廣泛的搶救，有16隻穿山甲死亡。死亡穿山甲以肺腫大為主，肺內含泡狀液體，有肺纖維化症狀，少數死亡穿山A肝脾腫大。我們從11具馬來穿山甲屍體收集了21個有明顯症狀的肺、淋巴和脾臟器官樣本，通過病毒宏基因組技術來發現病毒多樣性和潛在病毒病因的分子流行病學。本研究對穿山甲疾病的研究及後續的救援工作具有一定的參考價值。
結果
1. 病毒宏基因組
三對廣東省野生動物救援中心提供的11隻死亡馬來亞穿山甲身上收集肺、淋巴和脾臟共21份樣本，對其進行深度測序，共獲得227.32 GB的原始數據，其中有233587條reads與NCBI的NR資料庫中的病毒序列高度相似，共注釋到了28個病毒家族，其中豐度最高的是皰疹病毒科和副粘病毒科（圖1）。
圖1. 不同器官病毒序列組成分析
使用MEGAHIT 1.0版本根據overlap關係對clean reads進行組裝，一共獲得62508個重疊群(contigs)，將這些重疊群使用BLAST的方式進行病毒鑑定，共確認68個已知病毒，其中DNA病毒占20.59%而RNA病毒占79.41%。而有3532個contigs通過分析被劃為疑似病毒，其中DNA病毒占66.53%而RNA病毒占33.47%,。在帶有病毒注釋的重疊群中選取豐度前30的進行熱圖繪製，發現大部分為副粘病毒科、黃病毒科和偽病毒科（圖2）。
圖2. 測序reads豐度前30的contigs在每個樣本的情況
2. 仙台病毒
在11隻馬來亞穿山甲中有6隻發現了仙台病毒，推測此病毒在穿山甲身上為普遍存在，其中從個體19的肺組織中成功組裝出長度為13232 bp的病毒序列，占仙台病毒基因組總長（15384 bp）的86%，具有高度一致性，而其他注釋為仙台病毒的contigs長度範圍為：608~7027 bp。從ViPR資料庫下載了人源、鼠源和猴源的仙台病毒全序列與組裝得到的13232 bp長的仙台病毒序列進行進化樹分析，發現馬來亞穿山甲體內的仙台病毒與人源的仙台病毒相似度最高，與鼠源的仙台病毒相似度最低。
3. 冠狀病毒
在11隻馬來亞穿山甲中有2隻（07和08號個體）體內發現了冠狀病毒科的成員。在這些穿山甲標本中，產生了更長的重疊群，長度範圍為503~2330 bp。雖然發現的冠狀病毒種類較多，但其中SARS-CoV分布最廣、豐度最高。從ViPR資料庫下載來自不同宿主的Alphacoronavirus，Betacoronavirus，Gammacoronavirus和Deltacoronaviruses的全基因組序列。與本項目中鑑定到的16個冠狀病毒序列一併進行進化樹分析（圖3），系統發育分析表明冠狀病毒重疊群與冠狀病毒屬間存在多種關係。
圖3. 冠狀病毒進化樹分析
（註：黑星號的為本文組裝得到的冠狀病毒序列）
結論
我們發現馬來亞穿山甲的病毒多樣性很高，仙台病毒和冠狀病毒可能是導致它們死亡的主要病原體。仙台病毒表現出馬來亞穿山甲與人類分離株的密切關係，而冠狀病毒序列表現出高度的物種多樣性。為了更好地闡明它們的致病作用，還需要進一步的研究來比較這些病毒在健康和患病穿山甲個體中的發病率。這是我國首次對穿山甲病毒多樣性進行宏基因組研究。這項研究擴展了我們對瀕危物種病毒多樣性的理解，以及直接或間接跨越到其他哺乳動物的能力。
撰文：李傑 常熟理工學院生物與食品工程學院
責編：劉永鑫 中科院遺傳發育所
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Ping Liu, Wu Chen and Jin-Ping Chen, Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica), Viruses 2019, 11, 979; doi:10.3390/v11110979 https://www.mdpi.com/1999-4915/11/11/979
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2019 SCI期刊影響因子新鮮出爐-病毒學領域 https://www.sohu.com/a/322401371_749000
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專家：
穿山甲可能不是唯一的中間宿主 https://baijiahao.baidu.com/s?id=1657852915075121158&wfr=spider&for=pc
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